Partes, tipos y funciones de cada uno
Tipos de microscopios y funciones
Microscopio óptico de contraste de fase
Para observar una célulaviva, se utiliza un microscopio de contraste de fase, que tiene un dispositivo que transforma las diferencias de fase de la longitud de onda de la luz empleada, en diferencias de amplitud. La luz, al atravesar una muestra, es desfasada normalmente con respecto a la luz que atraviesa el medio donde se encuentra dicha muestra (agua, aire, aceite. etc.). Este desfasaje es pequeño y el ojo humano no es capaz de distinguirlo pero mediante dispositivos que existen en estos microscopios, la diferencia de fase se aumenta lo suficiente como para que el ojo lo distinga.
Microscopio de campo oscuro
La luz se dispersa en los límites entre los diversos materiales con diferentes índices de refracción. El condensador especial paraboloide ilumina el objeto oblicuamente. No entra luz directa en el objetivo por lo que el objeto aparece brillante a causa de la dispersión de la luz, mientras el fondo permanece oscuro.
Examen de microorganismos sin teñir suspensos en líquido (preparaciones “húmedas” y en gota pendiente), fitoplancton marino.
Microscopio de luz ultravioleta y de fluorescencia
La luz ultravioleta, que no es visible al ojo humano, pero que si se puede utilizar en microfotografía, tiene una longitud de onda muy corta (300 µm) y es absorbida por algunos componentes celulares como los ácidos nucleicos, o por determinadas sustancias que se le pueden suministrar a las células.
El microscopio de luz ultravioleta puede utilizarse para la toma de microfotografías usando una película sensible a esta radiación, o imágenes captadas por una cámara de televisión sensible a la luz ultravioleta. Sirve para detectar y cuantificar ácidos nucleícos y proteínas con determinados amino ácidos.
Diatomeas en Microscopia de fluorescencia
El microscopio de fluorescencia utiliza luz ultravioleta como fuente. Se utilizan colorantes especiales o fluorocromos, los cuales, dependiendo del tipo empleado y de la energía de excitación, emitirán una longitud de onda que mediante filtros puede ser observado por ojo humano.
Un ejemplo de esta técnica, consiste en suministrar a células vivas en cultivo o a animales de investigación vivos, uno de estos reactivos y examinar después al microscopio de fluorescencia. Por ejemplo, usando naranja acridina como fluorocromo se puede demostrar la localización de ADN, al cual se le observa una fluorescencia de color verde naranja en el núcleo de las células que han captado dicho colorante.
Microscopio confocal
Fibroblastos en Microscopía confocal
El principio es el de un microscopio de fluorescencia, pero se utilizan dos diafragmas confocales “pinhole” (uno antes de la muestra y otro después), y enfocan la iluminación en un punto único de la muestra. Utiliza el láser como fuente luminosa monocromática, que va barriendo la muestra por todo su volumen, plano a plano, creando imágenes 2D (dos dimensiones) que una computadora interpreta, generando una imagen 3D del objeto. Se utiliza en tejidos intactos y en secciones gruesas sin hacer cortes histológicos. Se utiliza en monitorear el calcio en las células, localizar anticuerpos, realizar hibridación in situ de alta resolución para localizar la posición de secuencias de ácidos nucleícos en células, visualizar células en tercera dimensión.
Microscopía multifotónica
Nuevas aplicaciones van desde un láser de excitación hasta un multifotón. La microscopía multifotónica se basa en la estimulación de un fluorocromo de modo simultáneo por 2 ó más fotones. La energía de ambos se suma y juntos son capaces de estimularlo del mismo modo que lo haría un solo fotón con el doble de energía (doble de frecuencia). Permite excitar un fluorocromo con absorción en luz ultravioleta, con 2 fotones de λ cercana al infrarrojo (700 nm).
Microscopio de fuerza atómica
Imagen de la superficie de un pelo
El Microscopio de Fuerza Atómica (MFA) es un instrumento mecano-óptico capaz de detectar fuerzas del orden de los nanonewton. Al analizar una muestra, se registra continuamente la altura sobre la superficie de una sonda o punta cristalina de forma piramidal. La sonda va acoplada a un listón microscópico, muy sensible al efecto de las fuerzas, de sólo unos 200 μm de longitud.
El microscopio de FA, puede realizar dos tipos de medidas: imagen y fuerza. Es útil en estudios de fuerzas de adhesión y permiten estudiar interacciones específicas entre moléculas (ej: interacción antígeno-anticuerpo, interacción entre hebras complementarias de ADN) o interacciones estructurales de las biomoléculas (plegado de proteínas).
Microscopio electrónico de transmisión
Como ya tratamos, los electrones al tener una longitud de onda muy pequeña (0.005 nm) permiten a este instrumento un alto poder de resolución.
Imagen del núcleo de una célula plasmática en MET
La fuente de iluminación es un fino filamento de tungsteno (cátodo) que al ser calentado por el paso de una corriente emite electrones, pasando a través de este último por una apertura hacia una columna metálica hueca, donde existe un alto vacío para evitar que los electrones que viajan a través de ella sean difractados por moléculas extrañas.
La muestra se contrasta con sustancias que contienen metales pesados de alta densidad electrónica, los cuales presentan diversas afinidades por determinados componentes celulares.
Luego de atravesar la muestra, los electrones pasan inmediatamente a través de la lente objetivo, donde se forma una imagen primaria invertida, la cual es rectificada por una lente intermedia y proyectada hacia una pantalla fluorescente, formando la imagen final aumentada al chocar los electrones. y producirse una emisión de ondas en el rango de la luz visible.
Microscopio electrónico de barrido
Este microscopio se basa en el estudio de los electrones reflejados por una superficie. Un dispositivo integra la imagen, la cual se observa en un sistema de televisión; mediante este equipo es posible estudiar la estructura tridimensional de las superficies; por ejemplo, los cilios de una célula, la forma bicóncava de los hematíes, etcétera.
Este tipo de microscopio electrónico, dado su poder de resolución (alrededor de 20 nm o más), permite el estudio detallado de estructuras cuyas dimensiones se encuentran entre los límites de resolución del microscopio óptico (0.2 µm) y el microscopio electrónico de transmisión que puede alcanzar de 0.3-0.1 nm
Mastocito humano tratado con un secretagogo experimental que indujo degranulación mastocitaria, observado y fotografiado bajo microscópico electrónico de barrido Autoscan ETEC. X5000. Ganador del Concurso Tras las huellas de Cajal 2014. Autor: Alicia Penissi (Argentina). Cortesía de la autora
Belén Z. Iglesias Ramírez. 2017
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